Largomento si presta allo svolgimento di più di una tesi sperimentale
BACKGROUND
Gli enzimi ossidosqualene ciclasi e sterolo-3-chetoreduttasi hanno, nel lievito Saccharomyces cerevisiae, un rapporto di assistenza a senso unico: il primo è attivo solo in presenza del secondo, mentre non vale il contrario. Linterazione tra i due enzimi, la prima identificata tra enzimi della biosintesi degli steroli, è stata scoperta dal nostro gruppo di ricerca in collaborazione con il Prof. Martin Bard della Indiana University, presso il quale la dr. Silvia Taramino (post-doc del nostro gruppo) ha svolto parte del dottorato di ricerca. Recentemente, utilizzando una linea cellulare murina (NS0) caratterizzata dalla mancata espressione del gene per la sterolo-3-chetoreduttasi, abbiamo scoperto che in cellule di mammifero la ossidosqualene ciclasi non richiede lassistenza della reduttasi. Abbiamo quindi programmato di estendere ad altri organismi lindagine sullinterazione tra le due proteine. Linteresse per questa interazione è duplice, speculativo (di base) e applicativo. Siamo infatti interessati a determinare a che punto del processo evolutivo della biosintesi degli steroli è venuta meno la capacità protettiva della reduttasi nei confronti della ciclasi, ma siamo altresì interessati a completare la caratterizzazione di un enzima che, nelluomo, fa parte di un gruppo di enzimi associati a gravi patologie ereditarie (disordini del metabolismo del colesterolo).
FASE A Studio della capacità protettiva di 3-chetoreduttasi diverse espresse in lievito nei confronti della ossidosqualene ciclasi di lievito
In questa fase del progetto verranno costruiti ceppi di lievito esprimenti le sterolo-3-chetoreduttasi (Erg27p) di Botrytis cinerea, Schizosaccharomyces pombe, Arabidopsis thaliana, Mus musculus e Homo sapiens.
Scopo di questa fase è valutare se la ossidosqualene ciclase di questi ceppi esprimenti 3-chetoreduttasi non di lievito è attiva, e identificare quindi quale reduttasi manifesta capacità protettive sulla ciclasi di lievito.
ARTICOLAZIONE DELLA FASE A PROGETTO
-Estrazione del DNA genomico da cellule di Botrytis cinerea, Schizosaccharomyces pombe, Arabidopsis thaliana.
-Costruzione di lieviti ricombinanti esprimenti le sterolo-3-chetoreduttasi (Erg27p) di Botrytis cinerea, Schizosaccharomyces pombe, Arabidopsis thaliana. Quelli esprimenti gli enzimi di S. cerevisiae, Mus musculus (topo) e Homo sapiens sono già disponibili.
-Determinazione della capacità di complementazione dei geni ERG27 di organismi diversi espressi in lievito attraverso Spot Plates.
-Valutazione dellintegrità della via biosintetica degli steroli attraverso incubazioni di colture cellulari con acetato radioattivo e analisi Radio-TLC dellestratto insaponificabile.
-Preparazione di omogenati cellulari da colture cellulari di lieviti ricombinanti.
-Incubazione degli omogenati cellulari con squalene epossido radioattivo e determinazione dellattività ossidosqualene ciclasica.
FASE B Studio della funzionalità della ossidosqualene ciclasi in organismi ricombinanti privi del gene per la sterolo-3-cheto reduttasi
In questa fase del progetto si costruiranno linee cellulari di Botrytis cinerea, Schizosaccharomyces pombe e Arabidopsis thaliana prive del gene per la sterolo-3-chetoreduttasi.
Scopo del progetto è determinare leffetto dellassenza della 3-chetoreduttasi sulla funzionalità della ossidosqualene ciclasi in organismi diversi dal lievito.
ARTICOLAZIONE DELLA FASE B DEL PROGETTO
-Costruzione di linee cellulari di Botrytis cinerea, Schizosaccharomyces pombe e Arabidopsis thaliana prive del gene per la sterolo-3-chetoreduttasi.
-Valutazione dellintegrità della via biosintetica degli steroli attraverso incubazioni di colture cellulari con acetato radioattivo e analisi Radio-TLC dellestratto insaponificabile.
-Incubazione degli omogenati cellulari con squalene epossido radioattivo e determinazione dellattività ossidosqualene ciclasica.
TECNICHE SPERIMENTALI
-Tecniche di biologia molecolare (PCR, digestione con enzimi di restrizione, estrazione DNA plasmidico, tecniche di clonazione, elettroforesi DNA, trasformazione di cellule di E. coli e S. cerevisiae con DNA plasmidico)
-Colture cellulari
-Omogeneizzazione e frazionamento subcellulare
-Test di complementazione (Spot plates)
-Determinazione di attività enzimatiche con traccianti radioattivi
-Cromatografia su strato sottile
-Tecniche di manipolazione di molecole marcate
-Tecniche di conteggio della radioattività (radioscansione e scintillazione liquida).
