BACKGROUND
Il progetto nasce dallosservazione casuale che il FENEXAMIDE, potente fungicida usato in agricoltura, è un inibitore specifico, nel fungo Botrytis cinerea (muffa grigia), della sterolo 3-chetoreduttasi, un enzima che il nostro gruppo studia da anni in Saccharomyces cerevisiae.
Studi di tossicità condotti da altri gruppi hanno rivelato che il fenhexamide ha una bassa tossicità su organismi diversi, uomo compreso. Anche leffetto sul lievito durante la fermentazione alcolica sembra essere modesto. Non è mai stato chiarito, però, se la diversità di citotossicità tra Botrytis cinerea e altri organismi dipende dalla diversa specificità di azione del composto sullenzima di tali organismi o da altri fattori. Non sono mai state chiarite, quindi, le basi molecolari della specificità di azione del fenhexamide.
PROGETTO
Leffetto inibitorio del Fenexamide verrà studiato in omogenati di lievito esprimenti la sterolo-3-cheto reduttasi di organismi diversi, incubati con 3-chetosteroidi radioattivi.
Scopo del progetto è determinare la specificità di inibizione del fenexamide e di riconoscere la basi molecolari di tale specificità.
ARTICOLAZIONE DEL PROGETTO
-Estrazione del DNA genomico da cellule di Schizosaccharomyces pombe, Botrytis cinerea e Arabidopsis thaliana (per gli ultimi due organismi sono stati presi contatti con il Dipartimento di Biologia Vegetale dellUniversità di Torino).
-Costruzione di lieviti ricombinanti esprimenti le sterolo-3-chetoreduttasi di Botrytis cinerea, Schizosaccharomyces pombe, Arabidopsis thaliana. Quelli esprimenti gli enzimi di S. cerevisiae, Mus musculus (topo) e Homo sapiens sono già disponibili.
-Preparazione dei 3-chetosteroidi radioattivi per via biologica.
-Preparazione di omogenati cellulari da colture cellulari di lieviti ricombinanti.
-Incubazione degli omogenati cellulari con i substrati radioattivi dellenzima sterolo-3-chetoreduttasi, in presenza di fenhexamide a diverse concentrazioni.
-Analisi dei risultati: tipo di inibizione, IC50, Ki ecc
TECNICHE SPERIMENTALI
-Tecniche di biologia molecolare (PCR, digestione con enzimi di restrizione, estrazione DNA plasmidico, tecniche di clonazione, elettroforesi DNA, trasformazione di cellule di E. coli e S. cerevisiae con DNA plasmidico)
-Colture cellulari
-Omogeneizzazione e frazionamento subcellulare
-Determinazione di attività enzimatiche con traccianti radioattivi
-Cromatografia su strato sottile
-Tecniche di manipolazione di molecole marcate
-Tecniche di conteggio della radioattività (radioscansione e scintillazione liquida).
