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BACKGROUND Gli enzimi sterolo C-4 metilossidasi e sterolo 3-idrossideidrogenasi 4-decarbossilasi appartengono al complesso della C-4 demetilasi, complesso enzimatico fondamentale della fase post-squalenica della sintesi dell’ergosterolo in funghi e lieviti, e del colesterolo nei mammiferi. Nell’uomo, la fase post-squalenica della sintesi del colesterolo è particolarmente critica per la corretta formazione degli organi durante lo sviluppo embrionale. Sono note diverse patologie malformative ereditarie associate alla carenza di uno dei geni di questa sezione della via metabolica. Il nostro gruppo di ricerca è interessato da anni alla caratterizzazione di alcuni enzimi post-squalenici della sintesi degli steroli, utilizzando il lievito sia come modello sia come sistema di espressione. Il lievito è un organismo unicellulare che ha in comune con l’uomo molti meccanismi molecolari che regolano i processi vitali e che è pertanto largamente utilizzato come modello per lo studio delle alterazioni molecolari responsabili di molte gravi patologie, incluso il cancro. PROGETTO Gli enzimi sterolo C-4 metilossidasi e sterolo 3-idrossideidrogenasi 4-decarbossilasi utilizzano 3-beta-idrossi steroli come substrati. Scopo del lavoro è verificare se la configurazione beta è critica per il processo catalitico. ARTICOLAZIONE DEL PROGETTO -Preparazione dei substrati radioattivi per via biologica: -isolamento di 3-chetosteroidi radioattivi in ceppi di lievito ingegnerizzati, incubati con precursori marcati; -riduzione chimica dei 3-chetosteroidi radioattivi con NaBH4 e separazione per TLC di 3alfa-OH e 3beta-OH steroli radioattivi; -preparazione dei substrati freddi per via biologica: -isolamento di 3-chetosteroidi freddi in ceppi di lievito ingegnerizzati; -riduzione chimica dei 3-chetosteroidi freddi con NaBH4 e separazione per TLC di 3alfa-OH e 3beta-OH steroli; -invio dei campioni al prof. Martin Bard (Indiana University, USA) per l’analisi GLC-MS ; -incubazione di preparati enzimatici di ceppi selvatici e mutanti con 3alfa-OH e 3beta-OH steroli radioattivi; -analisi dei risultati; TECNICHE SPERIMENTALI -Colture cellulari -Omogeneizzazione e frazionamento subcellulare -Determinazione di attività enzimatiche con traccianti radioattivi -Cromatografia su strato sottile -Tecniche di manipolazione di molecole marcate -Tecniche di conteggio della radioattività (radioscansione e scintillazione liquida).