STRUTTURA DELLE PROTEINE
Generalità sul riconoscimento molecolare. Panoramica sulle funzioni delle proteine. Gli amminoacidi delle proteine: proprietà generali, famiglie di amminoacidi. Struttura primaria delle proteine. Il gruppo peptidico: legame peptidico e conformazioni dello scheletro polipeptidico, angoli di torsione φ e ψ. Diagramma di Ramachandran. Strutture secondarie: a elica e foglietto b. Motivi strutturali. Le proteine fibrose. Proteine di membrana e globulari: struttura terziaria. I domini delle proteine globulari. Interazioni stabilizzanti e destabilizzanti nelle proteine. Effetto idrofobico. I ponti disolfuro. Struttura quaternaria. Il folding delle proteine in vitro e in vivo. Chaperon molecolari. Le malattie da misfolding. I prioni. Proteine coniugate e modificazioni post-traduzionali.
LE PROTEINE CHE TRASPORTANO L'OSSIGENO
II gruppo eme. Struttura e funzioni di mioglobina ed emoglobina. Affinità per l'ossigeno e per il CO. Curve di dissociazione dell'ossigeno: confronto tra mioglobina ed emoglobina. Effetto Bohr. Effetto del 2,3-bisfosfoglicerato. Emoglobina fetale. Emoglobina S. Metaemoglobina. Trasporto della CO2. Emoglobine patologiche.
GLICIDI
Funzioni dei glicidi. Classificazione. Monosaccaridi:aldosi e chetosi. Amminozuccheri, acido sialico e sialoglicoproteine. Zuccheri riducenti e non riducenti. Il legame glucosidico. Polisaccaridi: cellulosa, chitina, amido, glicogeno. Mucopolisaccaridi e mucopolisaccaridosi, eparina. Glicoproteine. Proteoglicani. Glicolipidi. I carboidrati come marcatori di superficie e recettori di segnali molecolari.
LIPIDI E MEMBRANE BIOLOGICHE
Definizione di "sostanze di natura lipidica". Ruoli biologici dei lipidi. Classificazione dei lipidi. Cere, triacilgliceroli, acidi grassi saturi e insaturi, glicerofosfolipidi, sfingolipidi, steroli e colesterolo, altri composti terpenici (vitamine A, D, E, K, ubichinone, dolicoli). I lipidi come segnali intracellulari (diacilglicerolo e ceramide) ed extracellulari (eicosanoidi). Architettura delle membrane biologiche: il modello a mosaico fluido e…il suo aggiornamento (lipid rafts). Fluidità delle membrane biologiche: effetto dei doppi legami e del colesterolo. Proteine di membrana: integrali, periferiche, monotopiche, GPI-anchored proteins.
ENZIMI - PRINCIPI DI CATALISI
Termodinamica delle reazioni: variazione di energia libera e costante di equilibrio. DG, DG0, DG0I. Velocità di reazione e stato di transizione (equazione di Arrhenius: ΔG di attivazione). Classificazione degli enzimi. Catalisi non covalente e covalente. Teoria dello stato di transizione. Un esempio riepilogativo: le proteasi. Le proteasi a serina: meccanismo di reazione, specificità, attivazione degli zimogeni, esempi. I proteasomi. Le caspasi e l'apoptosi. Proteasi e autofagia. Anticorpi catalitici. Ribozimi.
ENZIMI - CINETICA ENZIMATICA - LE EQUAZIONI FONDAMENTALI
Terminologia: velocità di reazione (v), velocità iniziale (v0), costanti di velocità (k), costanti di equilibrio (K, di dissociazione e di associazione), dimensioni delle costanti, attività enzimatica e velocità, attività enzimatica specifica. La base sperimentale dell'equazione di Michaelis e Menten. Cinetica di saturazione: equazione e grafico. I modelli interpretativi dell’equazione sperimentale. Significato dei parametri cinetici: KM, Vmax e kcat, kcat / KM; limiti superiori di kcat / KM ed enzimi "perfetti". Parametri cinetici degli enzimi regolatori e non regolatori: esempio della glicolisi. Effetto del pH e della temperatura sull'attività enzimatica. Rappresentazione grafica dei dati e determinazione dei parametri cinetici: equazione e grafico di Lineweaver-Burk (limiti e pregi).
ENZIMI - INIBITORI E REGOLAZIONE
Inibitori reversibili e irreversibili. Inibitori reversibili competitivi, acompetitivi, misti e non competitivi. Esempi di inibitori competitivi analoghi di substrato e di stato di transizione. Inibitori irreversibili: inibitori diretti al sito e inibitori suicidi (esempi). Controllo della disponibilità e dell’attività degli enzimi. Tipi di regolazione (esempi). Regolazione allosterica. Cooperatività: modello concertato e modello sequenziale. Attivatori e inibitoli allosterici.
INTRODUZIONE AL METABOLISMO
Generalità sul metabolismo. Processi catabolici, processi biosintetici, processi anfibolici. Termodinamica delle vie metaboliche: ΔG, ΔG°, ΔG°I. Reazioni esoergoniche, endoergoniche e all’equilibrio. ATP: struttura, proprietà, tipo di reazioni ATP-dipendenti, vie di sintesi dell’ATP. Carica energetica della cellula. Metastabilità dell'ATP. Composti ad elevato potenziale di trasferimento del fosfato. Composti ad "alta energia". Coenzimi e vitamine. Coenzima A, reattività dei tioesteri. NADH: reazioni "solite" (deidrogenazioni) e "insolite" (adenilazioni, ADP-ribosilazioni). NADPH: ruolo, distribuzione cellulare, confronto con il NADH. FAD, FMN e flavoproteine. Altri coenzimi derivanti da vitamine: lipoammide, piridossal fosfato, S-adenosil-metionina, tetraidrofolato, biotina, tiamina pirofosfato, coenzima B12, metil-cobalamina. Acido ascorbico. Riepilogo sul controllo (termodinamico e cinetico) del flusso metabolico: tappe di controllo e minimizzazione dei cicli futili..
GLICOLISI
Generalità sul metabolismo dei carboidrati. La “dote” energetica di un metabolita (confronto tra glicidi e lipidi). Ruolo centrale del glucosio-6-fosfato. Reazioni ed enzimi della glicolisi. Meccanismo di reazione della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi. Termodinamica della glicolisi: DG°I e DG delle reazioni. Regolazione della glicolisi: enzimi regolatori e loro modulatori. Il fruttoso-2,6-bisfosfato e l'enzima tandem chinasi-fosfatasi. Sintesi del 2,3-bisfosfoglicerato. Destino del piruvato. Fermentazione lattica e alcolica. Collegamento della glicolisi con il metabolismo lipidico.
CICLO DELL'ACIDO CITRICO (CICLO DI KREBS)
II complesso della piruvato deidrogenasi: reazioni, enzimi e coenzimi. Fonti metaboliche di acetil CoA. Reazioni ed enzimi del ciclo. Termodinamica e regolazione (ruolo di ATP e NADH). Ruolo catabolico e biosintetico del ciclo di Krebs. Reazioni anaplerotiche. Collegamento tra il ciclo di Krebs e le altre vie metaboliche. Il ciclo del gliossilato.
TRASPORTO DEGLI ELETTRONI E FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA
Potenziali redox e termodinamica delle reazioni di ossidoriduzione. I quattro complessi della catena respiratoria e i siti di accoppiamento. Trasportatori fissi e mobili di elettroni: ubichinone, citocromo c e altri citocromi, centri FeS, coenzimi flavinici, centro binuclearFe-Cu. I fornitori di elettroni all'ubichinone. Accoppiamento tra flusso degli elettroni e fosforilazione ossidativa. Sintesi dell'ATP: ipotesi chemiosmotica. Struttura e funzione dell'ATP sintasi. Regolazione. Principali inibitori della fosforilazione ossidativa. Il disaccoppiamento. Sistemi navetta per il trasporto degli elettroni del NADH citosolico. Citocromo c e apoptosi.
VIA DEI PENTOSO FOSFATI
Generalità, scopi e confronto con la glicolisi. Corredo enzimatico della via dei pentoso fosfati: fase ossidativa e fase non ossidativa. Quattro "scenari metabolici" legati al fabbisogno di NADPH, riboso-5-fosfato e ATP. Fonti di NADPH alternative alla via dei pentosi: enzima malico. NADPH e glutatione reduttasi. Favismo e altre carenze di glucoso-6-fosfato deidrogenasi. Funzioni del NADPH. Reazioni monossigenasiche.
METABOLISMO DEL GLICOGENO
Struttura e funzione del glicogeno. Demolizione del glicogeno: scissione fosforolitica, enzimi deramificanti. Fosfoglucomutasi e destino del glucoso-6-fosfato. Sintesi del glicogeno: ruolo di glicogenina e UDP-glucoso. Enzima ramificante. Costi della sintesi del glicogeno. Regolazione del metabolismo del glicogeno. Il calcio e la calmodulina.
GLUCONEOGENESI
Generalità: il glucosio….ad ogni costo! II glucosio da precursori non glicidici: glicerolo, lattato, alanina-piruvato, amminoacidi (ruolo-cerniera del ciclo di Krebs). Confronto tra glicolisi e gluconeogenesi. La piruvato carbossilasi, un enzima polifunzionale. Gli altri enzimi "peculiari" della gluconeogenesi: PEP-carbossichinasi, fruttoso-l,6-bisfosfatasi e glucoso-6-fosfatasi. Il ciclo di Cori e il ciclo dell’alanina. Regolazione ormonale del metabolismo glicidico: glucagone, adrenalina, cortisolo.
METABOLISMO LIPIDICO - GLI ACIDI GRASSI
Degradazione e sintesi dei triacilgliceroli nel duodeno, negli adipociti e nel fegato. Destino metabolico di glicerolo e acidi grassi. Degradazione degli acidi grassi. Attivazione degli acidi grassi e trasferimento nella matrice mitocondriale. La b-ossidazione: reazioni, enzimi e coenzimi. Bilancio energetico della b-ossidazione. Ossidazione degli acidi grassi a catena dispari di atomi di carbonio. La chetogenesi e i corpi chetonici.
Sintesi degli acidi grassi: confronto con la b-ossidazione. Trasporto di equivalenti di acetil-CoA dal mitocondrio al citosol: ruolo del citrato e dell'enzima malico. La acetil-CoA carbossilasi: confronto con altri biotin-enzimi. Organizzazione strutturale della acido grasso sintasi animale. Reazioni della sintesi degli acidi grassi. Costi di trasporto e di produzione. Le prostaglandine. Regolazione del metabolismo degli acidi grassi.
METABOLISMO LIPIDICO - I LIPIDI DI MEMBRANA E IL COLESTEROLO
Il metabolismo dei fosfolipidi (cenni). Il metabolismo degli isoprenoidi in procarioti ed eucarioti: ramificazioni principali. Generalità sulla biosintesi del colesterolo: localizzazione cellulare, diramazioni, fabbisogno di NADPH e ATP (costi di produzione e costi di trasporto). HMG-CoA reduttasi e sintesi del mevalonato, trasformazione del mevalonato nell'unità isoprenica attivata, sintesi dello squalene e sua ossidazione, ciclizzazione dello squalene epossido (esempi di ciclasi animali e vegetali), trasformazione del lanosterolo in colesterolo (patologie associate, ruolo delle monossigenasi). Il carattere aerobico della sintesi del colesterolo. I fattori SREBP e le proteine Hedgehog. Le lipoproteine. Il controllo della biosintesi e del trasporto del colesterolo. L'ipercolesterolemia famigliare. Vecchi e nuovi inibitori della biosintesi del colesterolo. Derivati del colesterolo: ormoni steroidei (glucocorticoidi, mineralcorticoidi, sessuali), steroidi neuroattivi, acidi biliari, vitamina D3, ossisteroli. Meccanismo d'azione degli ormoni steroidei. Biosintesi degli ormoni steroidei: ruolo delle monoossigenasi. La prenilazione delle proteine: le Ras-farnesil transferasi. Colesterolo (e derivati) e cancro.
METABOLISMO DEGLI AMMINOACIDI - CATABOLISMO
II catabolismo delle proteine della dieta e cellulari. Il sistema ubiquitina-proteasoma. Le proteine come riserva “remota” di glucosio. Destino metabolico degli amminoacidi: amminoacidi glucogenici e chetogenici. Deamminazione per transamminazione: meccanismo catalitico. Altre reazioni PLP-dipendenti. Deamminazione ossidativa: la glutamico deidrogenasi. Ruolo catalitico dell'a-chetoglutarato. Eliminazione dell'azoto: organismi ammoniotelici, uricotelici e ureotelici. Sintesi mitocondriale del carbammilfosfato. Ciclo dell'urea: reazioni ed enzimi. Collegameno tra il ciclo dell'urea e il ciclo di Krebs. Il ruolo centrale del glutammato nel metabolismo azotato. Compartimentazione cellulare e regolazione del ciclo dell’urea. Sintesi di creatina e fosfocreatina.
METABOLISMO DEGLI AMMINOACIDI - BIOSINTESI
Biogenesi dell'azoto organico: glutammato deidrogenasi, glutammina sintetasi. Amminoacidi essenziali e non essenziali. Caratteristiche generali della biosintesi degli amminoacidi. Famiglie biosintetiche degli amminoacidi. Sintesi per transamminazione da a-chetoacidi. Interconversione serina-glicina (enzima serina idrossimetil transferasi). Il metabolismo delle unità monocarboniose: i derivati del tetraidrofolato e la S-adenosil metionina. La metilcobalamina. Schema generale del metabolismo delle unità monocarboniose. Biosintesi della tirosina dalla fenilalanina: ruolo della biopterina. Fenilchetonuria e alcaptonuria. Biomolecole da amminoacidi (strutture, funzioni e aspetti biosintetici comuni). Arginina e NO.
METABOLISMO DEI NUCLEOTIDI
Funzioni dei nucleotidi. Struttura di nucleotidi, nucleosidi, basi puriniche e pirimidiniche. Aspetti generali del metabolismo dei nucleotidi: vie de novo e vie di recupero. Il 5-fosforibosilpirofosfato (PRPP), metabolita chiave delle vie biosintetiche dei nucleotidi. Origine degli atomi degli anelli purinico e pirimidinico e strategie biosintetiche. AMP e GMP da IMP. Formazione dei deossiribonucleotidi: la ribonucleotide reduttasi. Timidilato sintasi: meccanismo di reazione, inibitori, associazione funzionale con la diidrofolato reduttasi. Ipotesi sulla funzione del 5-metile nella timina. Recupero e degradazione dei nucleotidi. Costo della sintesi dei nucleotidi. Riepilogo sull’intreccio metabolico tra amminoacidi e nucleotidi.
CASCATE DI SEGNALAZIONE MOLECOLARE E INTEGRAZIONE DEL METABOLISMO
Segnali molecolari e apparati di interpretazione: generalità, recettori di membrana e recettori nucleari. Proteine G: proprietà generali e classi. Fattori traduzionali (v. anche: sintesi delle proteine - traduzione). Proteine Ras. Proteine G eterotrimeriche: struttura, classi, ciclo funzionale, cascate inibitorie e stimolatorie dell'AMPc, adenilato ciclasi, fosfodiesterasi (confronto con la cascata del cGMP), proteina chinasi A, tossine. Cascate del PIP2. Recettori-enzimi. Guanilato ciclasi di membrana e solubile. RTKs (receptors tyrosine kinases). Recettore dell'insulina e simili. Cenno ad altre cascate di segnalazione molecolare. Gli oncogèni e gli oncosoppressori.
STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI
Basi puriniche e pirimidiniche di DNA e RNA: forme tautomeriche e loro attitudine alla formazione di legami H. Differenze "chimiche" tra DNA e RNA. Rare Nucleic acid Components (RNC): esempi (basi modificate e altro), metilazioni e protezione da enzimi di restrizione. Struttura di un filamento polinucleotidico. La struttura a doppia elica del DNA. Regola di Chargaff. Appaiamenti standard tra le basi, appaiamenti fra tautomeri rari, impilamento delle basi, solchi maggiore e minore. DNA B, A e Z. Forze che stabilizzano la doppia elica del DNA. Il DNA a tripla elica. Denaturazione del DNA. Temperatura di fusione: dipendenza dalla percentuale di G--C. Topologia del DNA. Il DNA superavvolto e le topoisomerasi. Composizione della cromatina: gli istoni e i nucleosomi. Stabilità evolutiva degli istoni. Acidi ribonucleici: mRNA, tRNA, Rrna, microRNA, RNA virali..
REPLICAZIONE DEL DNA
Caratteristiche generali della replicazione: semiconservatività (esperimento di Meselson e Stahl), bidirezionallità (esperimenti con timidina triziata), unicità di origine nei procarioti (esperimenti con batteri in rapida crescita), semidiscontinuità (esperimenti di Okazaki). Le DNA polimerasi: meccanismo generale di reazione. Apparato di replicazione nei procarioti: elicasi, SSBP, primasi, DNA polimerasi III, DNA polimerasi I, DNA ligasi, topoisomerasi (girasi). La replicazione negli eucarioti. La trascrittasi inversa.
CODICE GENETICO E RNA DI TRASPORTO
Definizione di gene. Definizione e caratteristiche del codice genetico: triplette non sovrapposte, univocità, universalità, ridondanza, ridondanza ordinata. Origine del codice genetico. Decifrazione (esperimenti iniziali). L'RNA transfer: strutture primaria e secondaria, basi modificate, struttura terziaria. Le amminoacil-tRNA sintetasi: attivazione dell'amminoacido e caricamento sul tRNA. Classi I e II di amminoacil-tRNA sintetasi. Fedeltà del processo di caricamento dell'aminoacido sul tRNA. Appaiamento codone-anticodone. Appaiamenti oscillanti (esempio della leucina).
SINTESI E MATURAZIONE DELL'RNA - LA TRASCRIZIONE E LA SUA REGOLAZIONE
Le RNA polimerasi DNA dipendenti. Struttura dell'RNA polimerasi dei procarioti. Siti promotori in procarioti ed eucarioti, filamenti senso e antisenso. Sintesi dell'RNA su stampo di DNA: inizio, allungamento, terminazione. Le tre RNA polimerasi degli eucarioti. Proprietà catalitiche dell’RNA. Maturazione dei precursore del tRNA e dell’rRNA. Autosplicing e introni di tipo I e II. Maturazione del precursore del mRNA: formazione del cappuccio, metilazioni, poliadenilazione, rimozione degli introni. Discontinuità dei geni degli eucarioti (introni ed esoni): esperimenti di ibridazione DNA-mRNA. Gli spliceosomi e il processo di splicing: meccanismo, accuratezza, confronto con l'autosplicing. Splicing alternativo. Ipotesi sull'origine degli introni. Regolazione dell’espressione genica nei procarioti: operon catabolici (lac-operon) e biosintetici (Trp-operon). Il Lac-operon e il complesso cAMP-CAP. Il Trp-operon e il meccanismo di attenuazione. Cenno alla regolazione dell’espressione genica negli eucarioti: fattori di trascrizione, silenziamento genico, regolazione epigenetica.
SINTESI DELLE PROTEINE - LA TRADUZIONE
Composizione, struttura e localizzazione cellulare dei ribosomi di eucarioti e procarioti. Ruolo dei fattori GTPasici nella sintesi delle proteine. Sintesi di fMet-tRNA e fase di inizio nei procarioti. Fase di allungamento: ruolo di EF-Tu, EF-Ts, EFG, formazione del legame peptidico, traslocazione. Fase di terminazione. Costo energetico della sintesi delle proteine. Sintesi delle proteine negli eucarioti e sua regolazione (cenni). Inibitori della sintesi delle proteine: antibiotici, tossine.
